【教学目标】
第一节DNA重组和基因转移
掌握：转化及转导作用。
熟悉：基因重组的概念、过程和意义。
了解：接合作用；转座作用。
第二节重组DNA技术
掌握：重组DNA技术相关概念；限制性核酸内切酶的概念；重组DNA技术基本原理及操作步骤（分、切、接、转、筛）；载体的特点及质粒的概念。
熟悉：目的基因的获得途径；重组体的筛选方法。
了解：重组DNA技术与医学的关系；原核表达体系与真核表达体系的异同。
第三节重组DNA技术与医学的关系
了解：重组DNA技术在医学上的应用。
【考评测试】
一、单项选择题
1.下列哪种方法往往被用于转移重组DNA到大肠杆菌中去（）
A.CaCl2转化
B.磷酸钙转染
C.脂质体
D.基因枪
E.DEAE葡聚糖转染
2.质粒带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，目的基因插入抗四环素基因之中。请问，
将质粒导入细菌后，细菌能够在下列哪种培养基上生长（）
A.青霉素
B.氨苄青霉素
C.四环素
D.氯霉素
E.红霉素
3.转化过程中，宿主细胞需要被处理和诱导，形成哪种细胞才能接纳重组DNA（）
A.感受态细胞
B.原核细胞
C.真核细胞
D.冰冻细胞
E.破裂细胞
4.从mRNA合成cDNA使用的酶是（）
A.限制性内切酶
B.连接酶
C.DNA聚合酶
D.S1核酸酶
E.反转录酶
5.下列关于限制性内切核酸酶作用的描述中，正确的是（）
A.在对称序列处切开单链DNA
B.DNA两链的切点一定不在同一位点
C.酶切部位一定位于识别序列处
D.酶辨认的碱基一般为8～12个
E.酶切后产生的DNA片段多半具有黏性互补末端
6.限制性核酸内切酶识别的顺序通常是（）
A.基因的操纵序列
B.启动子序列
C.SD序列
D.回文结构
E.长末端重复序列
7.cDNA文库包括该种生物细胞中（）
A.某些蛋白质的结构基因
B.所有蛋白质的结构基因
C.所有结构基因
D.结构基因与不表达的调控区
E.内含子和调控区
8.常用质粒载体的特点是（）
A.为线性双链DNA分子
B.为环形单链DNA分子
C.具有自我复制能力
D.含有同一限制性内切酶的多个切点
E.缺乏表达外源基因的能力
9.基因工程的操作程序可简单地概括为（ ）
A.载体和目的基因的分离
B.分、切、接、转、筛、表达
C.将重组体导入宿主细胞，筛出阳性细胞株
D.将载体和目的基因连接成重组体
E.限制性内切酶的应用
10.下列DNA序列属于回文结构的是（）
A.ATGCCGTACGGC
B.GGCCGGCCGGCC
C.CTAGGGGATCCC
D.GAATTCCTTAAG
E.TCTGACAGACTG
11.下列关于建立cDNA文库的叙述中，错误的是（）
A.从特定组织或细胞中提取mRNA
B.将特定细胞的DNA用限制性内切核酸酶切割后，克隆到噬菌体或质粒中
C.用逆转录酶合成mRNA的对应单股DNA
D.用DNA聚合酶以双股DNA为模板合成双链DNA
E.加S腺苷甲硫氨酸（SAM），以使新生的DNA双链甲基化
12.完整的DNA克隆技术包括：①目的基因的获得；②基因载体的选择与构建；③目的基因与载体的连接；④筛选并无性繁殖含重组分子的受体；⑤重组DNA分子导入受体。正确顺序为（）
A.①，②，③，④，⑤
B.②，①，③，④，⑤
C.②，①，③，⑤，④
D.④，⑤，①，②，③
E.①，②，③，⑤，④
13.在分子生物学领域，重组DNA技术又称（ ）
A.蛋白质工程
B.酶工程
C.细胞工程
D.基因工程
E.DNA工程
14.重组DNA技术常用的限制性核酸内切酶为（）
A.Ⅰ类酶
B.Ⅱ类酶
C.Ⅲ类酶
D.Ⅳ类酶
E.Ⅴ类酶
15.已知人乳腺来源的某长度为1.5kb的基因序列，获取该目的基因最方便的方法是（）
A.化学合成法
B.基因组文库法
C.cDNA文库法
D.聚合酶链反应
E.差异显示法
16.α-互补筛选法属于（）
A.抗药性标志筛选
B.酶联免疫筛选
C.标志补救筛选
D.原位杂交筛选
E.Southern杂交筛选
17.真核表达载体不含有（）
A.选择标记
B.启动子
C.转录翻译终止信号
D.mRNA加polyA信号
E.包涵体
18.用来鉴定DNA的技术是（）
A.Northern印迹杂交
B.Western印迹杂交
C.Southern印迹杂交
D.离子交换层析
E.SDS‐PAGE
19.关于聚合酶链反应（PCR）的叙述错误的是（ ）
A.体外获得目的DNA广泛采用的一种方法
B.需要设计出合适的引物
C.催化反应的酶一般是依赖RNA的DNA聚合酶
D.类似于DNA的天然复制过程
E.PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成
20.在已知序列的情况下获得目的DNA最常用的是（）
A.筛选cDNA文库
B.筛选基因组文库
C.化学合成法
D.聚合酶链式反应
E.DNA合成仪合成
21.直接针对目的DNA进行筛选的方法是（）
A.氨苄青霉素抗药性
B.青霉素抗药性
C.分子杂交
D.分子筛
E.电泳
22.表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是（）
A.酵母表达体系
B.原核表达体系
C.E.coli表达体系
D.昆虫表达体系
E.哺乳类细胞表达体系
23.某限制性内切核酸酶按GGG▼CGCCC方式切割产生的末端突出部分含（）
A.1个核苷酸
B.2个核苷酸
C.3个核苷酸
D.4个核苷酸
E.5个核苷酸
24.某限制性内切核酸酶切割5′-…GGGGGG▼AATTCC…3′序列后产生（）
A.5′-突出末端
B.5′或3′-突出末端
C.5′及3′-突出末端
D.3′-突出末端
E.平末端
二、多项选择题
1.下列哪些可以构建载体（）
A.质粒
B.噬菌体
C.病毒
D.酵母人工染色体
E.哺乳动物人工染色体
2.基因工程DNA重组中至少要有下列哪些酶参加（）
A.限制性内切酶
B.连接酶
C.DNA聚合酶
D.S1核酸酶
E.反转录酶
3.下列哪些为聚合酶链式反应的步骤（）
A.变性
B.退火
C.延伸
D.速冻
E.热休克
4.常见的抗药性筛选有（）
A.抗青霉素
B.抗氨苄青霉素
C.抗四环素
D.抗氯霉素
E.抗红霉素
5.目的基因的制备可以通过（）
A.化学人工合成
B.基因文库
C.cDNA文库
D.PCR
E.空质粒
6.理想的载体应该具备哪些特征（）
A.能够自我复制
B.载体DNA和宿主细胞的染色体DNA易分开
C.可以装载较大相对分子质量的目的基因
D.具有多个单一限制性内切酶酶切位点
E.含有一个或多个筛选标记
7.用原核生物表达真核生物的基因存在的问题是（）
A.缺乏翻译后加工机制
B.包涵体去除困难
C.缺乏翻译后修饰
D.蛋白产物不能形成高级结构
E.缺乏转录后加工机制
8.原位杂交包括（）
A.转膜杂交
B.斑点杂交
C.菌落杂交或噬菌体杂交
D.直接对染色体或组织的杂交
E.Northern杂交
9.常用载体有（）
A.质粒
B.噬菌体
C.病毒DNA
D.大肠杆菌基因组DNA
E.YAC
10.一般说来，限制性内切核酸酶（）
A.只识别一种核苷酸序列
B.其识别不受DNA来源的限制
C.不同生物的DNA经同一限制性酶切割后产生相同末端
D.对双链DNA和单链DNA一视同仁
E.识别的序列为8～16个碱基
11.经限制性内切核酸酶切割后的DNA可产生以下哪些情况（）
A.产生带有5′磷酸基的伸出股
B.黏性末端
C.钝末端（平头）
D.产生带有3′-OH的伸出股
E.单链DNA
12.下列哪些方法可应用于重组体的筛选（）
A.抗药性标记筛选
B.营养突变株筛选
C.α-互补筛选
D.原位杂交筛选
E.免疫化学方法筛选
三、名词解释
1.基因工程
2.质粒
3.载体
4.限制性内切酶
5.聚合酶链式反应
6.cDNA文库
四、简答题
1.简述基因工程的基本原理和一般过程。
2.如何获取目的基因？
3.简述PCR的基本工作原理及其应用。
【科学素养读物】
限制性内切酶的发现与发展
20世纪60年代，人们提出限制性内切酶和限制酶的概念。
1968年，首次从E.coliK中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达1000bp以上。
1970年，美国约翰·霍布金斯大学的H.Smith偶然发现，流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，从而找到HindⅡ限制性内切酶。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具，EcoRⅠ是应用最广泛的限制性内切酶。
当限制性内切酶的应用在20世纪70年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。
限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如PvuⅡ（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的CjeⅠ更大。在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。
20世纪80年代，NEB开始克隆并表达限制性内切酶。克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来，避免了原细胞中其他内切酶的污染，从而提高了酶的纯度。此外，克隆技术提高了限制性内切酶的产量，简化了纯化过程，使得生产成本显着降低；克隆的基因很容易进行测序分析，表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析，这使得我们对于克隆产物更加确定。
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可以分为如下四类：
Ⅰ型（typeⅠ）：限制与修饰系统的种类很少，只占1%，如EcoK和EcoB。其限制酶和甲基化酶（即R亚基和M亚基）各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别DNA序列的S亚基，分别由hsdR、hsdM和hsdS基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK编码基因的结构为R2M2S。EcoB编码基因的结构为R2M4S2。但是EcoB酶和EcoK酶的切割位点在识别位点1000bp以外，且无特异性。
Ⅲ型（typeⅢ）：限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到1%，如EcoP1和EcoP15。
它们的识别位点分别是AGACC和CAGCAG，切割位点则在下游24～26bp处。
Ⅱ型（typeⅡ）：限制与修饰系统所占的比例最大，达93%。Ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3′-羟基和5′-磷酸基团的DNA产物，需Mg2＋的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。识别序列主要为4～6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。
Ⅱs型（typeⅡs）：限制与修饰系统，占5%，与Ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为4～7bp，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。
Ⅱ型限制酶一般是同源二聚体，由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在DNA链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。
在Ⅱ型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链DNA中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶，如N.BstNBI。
1978年，WernerArber（瑞士）、DanielNathans（美）和HmiltorO.Smith（美）因为发现限制性内切酶以及在分子遗传学方面的应用而获得诺贝尔生理学或医学奖。（王建光）
