1.试剂配制
（1）Giemsa原液。
天青Ⅱ‐伊红2.0g、天青Ⅱ1.0g、天青B‐伊红1.0g、天青A‐伊红0.5g，将250ml甘油与250ml甲醇混合，在该溶液中溶解所有染料，室温过夜，振荡混合物5～10min，然后倾入黑色罗口瓶中，不用过滤，室温保存。
（2）Giemsa工作液。
将5mlGiemsa原液与65ml水混合。
近年来的改进配方：
（1）Giemsa原液。
Giemsa粉0.5g、甘油22ml，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余的甘油混在一起，56℃保温2h后，加入33ml纯甲醇，保存于棕色瓶内。
（2）Sorensen缓冲液（pH6.81～7.38）。
pH6.81：Na2HPO4（1／15mol／L）50ml＋KH2PO4（1／15mol／L）50ml
pH6.88：Na2HPO4（1／15mol／L）60ml＋KH2PO4（1／15mol／L）40ml
pH7.17：Na2HPO4（1／15mol／L）70ml＋KH2PO4（1／15mol／L）30ml
pH7.38：Na2HPO4（1／15mol／L）80ml＋KH2PO4（1／15mol／L）20ml
（3）Giemsa工作液。用pH6.81～7.38的Sorensen缓冲液，按1∶8比例取Giemsa原液和Sorensen缓冲液混合配成Giemsa工作液。
2.染色步骤
（1）蒸馏水快速浸洗15次。
（2）Giemsa工作液2h。
（3）1%醋酸快速浸洗1次。
（4）吸水纸吸干。
（5）100%甲醇，直到只有轻微蓝色从涂片进入甲醇液中再取出涂片。
（6）二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸洗10次，中性树胶封片。
3.染色结果。细胞核呈紫蓝色或深紫色，胞浆呈粉红色，其中嗜酸性颗粒粉红色，嗜天青、嗜碱性颗粒紫蓝色或深蓝色。红细胞橙黄色或浅红色，淋巴细胞紫蓝色。
4.注意事项
（1）有报道将自然干燥的细胞涂片滴加数滴甲醇预固定10min，或用1∶3醋酸／甲醇固定30min。
（2）Giemsa工作液，稀释后液面应浮露金黄色金属光泽，表示染液起了作用，否则染色失败。
（3）改进Giemsa工作液可缩短染色时间至10～15min，但染色液宜现用现配，保存时间不超过48小时。
（4）改进Giemsa工作液所用缓冲液pH值要准确，否则影响染色效果。
（5）用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化物后，再进行染色。
（6）染色后可用多量蒸馏水急速冲洗，以免沉淀物玷污涂片，不能洗脱。
（7）染色过深，可表现为镜下细胞变小，核与浆均呈深蓝黑色，结构不清，红细胞呈碱性色。可能原因：染色时间过长，染液过多或染液偏碱，夏季染色过程中甲醇挥发。染色过浅，可表现为胞浆、浆内颗粒及核均不着色或着色过浅，红细胞亦不着色。可能原因：染色时间过短，染液过少或染液偏酸。
（8）如染液过碱，可向其中加1%醋酸少许，或将涂片浸于85%酒精中数秒，然后冲洗。
染色偏酸较少见，可新旧染液混合使用，借以调整其pH值，或于染液中加2%碳酸钠适量。
（8）染前用蛋白酶等进行处理，再行姬姆萨染液染色，在染色体上可以出现不同浓淡的横纹样着色。
（五）Romanowsky‐Giemsa染色法（R‐G染色法）
在血涂片或白血病细胞形态学检查中，国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐使用罗氏（Romanowsky）染色法，目前国内多采用瑞氏（Wright）染色法、Giemsa或Wright‐Giemsa混合染色法。1878年Wittekind等指出用纯天青B及伊红Y可得到完美的Romanowsky‐Giemsa染色（R‐G染色），美蓝可省去，这项工作已被Galbraith（1880）、Marshall（1881）和Lapen（1882）重复证实。应用显微分光光度计显示，R‐G染色之后，核有3个吸收波段：A1（15400／cm，648nm）、A2（16800／cm，585nm），这是DNA与天青B的单体及二聚体结合的结果；第3个吸收波段称为RB（18100／cm，552nm），被认为是DNA‐高聚合天青B‐伊红Y的复合物，也就是Giemsa染色中细胞核呈紫色的基础。胞浆染色的吸收光谱也有3个带（pH≈7）：A1（15300／cm，654nm）、A2（16800／cm，582nm）及A3（17600／cm，588nm）。出现这3个波段的原因被归因于RNA与天青B的单体、二聚体或多聚体结合的结果。将“标准”液染色后的各种血细胞进行色泽分析，结果发现纯天青B及伊红Y两种染料各有两个聚合状态（单体和二聚体）。这4种成分在各个血细胞的结构中的比例不同，因而形成血细胞多色彩的表现。现将Wittekind（1887）使用的R‐G染色法介绍如下。
1.试剂配制
（1）R‐G贮存液。
天青B750mg
伊红Y（酸）120mg
将天青B溶于75ml二甲基亚砜（DMSO），伊红Y溶于25ml二甲基亚砜（DMSO），混合后，置于深色瓶中，室温下可贮存数月。
（2）羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）pH6.5缓冲液。
100×贮存液（1mol／L）：23.8gHEPES溶于80ml双蒸水中，用1mol／LNaOH调pH至6.5，然后用水定容至100ml，过滤除菌，分装小瓶（2ml／瓶），4℃或－20℃保存。使用前取88ml双蒸水加入1ml贮存液，最终应用浓度为10mmol／L。
（3）R‐G工作液。
染血片，以1∶50V／V的HEPESpH6.5缓冲液稀释；
染骨髓片，以1∶25V／V的HEPESpH6.5缓冲液稀释。
2.染色步骤
（1）涂片常规甲醇固定。
（2）入R‐G工作液，血片染10～30min；骨髓片染15～35min。
（3）过缓冲液。
（4）过蒸馏水。
（5）晾干，有价值的片可二甲苯透明，封片后永久保存。
3.染色结果。细胞核依细胞成熟度不同而呈梯度染色改变，在以往专着中各种颜色如Digg等描述为亮红到深蓝，Miale认为是紫色到蓝色，Wintrobe则形容为紫红色到蓝紫色，胞浆呈粉红色。
4.注意事项
（1）湿片固定和空气中晾干的标本的R‐G染色有差别，空气中晾干对核着紫色有稳定作用。
（2）pH对R‐G染色的影响，类似Giemsa染料的pH值对红细胞色泽的影响，pH低时，伊红着色，pH高时呈蓝绿色。由于天青B仍与负电荷结合，pH7～8时，R‐G染色效果中的紫色深于pH6～5时，当pH3.5时，R‐G染色效果全部抑制，只出现两种颜色即蓝绿色的核和红色的细胞浆。
（3）缓冲液成分对染色结果也有影响，其中以HEPES缓冲液pH6.8效果最好，这是由于二价酸的盐效应较好，它不与组织中阳离子形成不溶性化合物。当缓冲液浓度达到0.05mol／L时，R‐G染色变浅。
（4）劣等的甲醇和乙醇对R‐G的影响极大。由于DMSO有利于天青B‐伊红Y复合物的稳定，能溶解多量伊红Y，不挥发，毒性低，易与甲醇及水混合，并对空气中干燥红细胞的耐受性优于甘油，因而被用来代替甘油。
（5）由于染色后细胞中各种成分的不同色泽取决于天青B（单体及二聚体）和伊红Y（单体及二聚体）4种成分的比值。因此染液中天青B与伊红Y的比值必然影响染色结果。用纯天青B和伊红Y的重量比为15∶1时可得到外周血和骨髓都满意的血细胞染色。建议采用安全比例，即碱性染料的量超过酸性染料。
（6）Horobin（1887）研究R‐G染色的时间影响，当延长染色时间到28小时，结果所有细胞成分均染成紫色，故R‐G染色中的紫色选择性只是一个反应速度现象。
附：R‐G染色出现问题的可能原因如下表所示。
问题可能原因
1.玻片上出现沉淀
（1）缓冲液浓度太高；
（2）甲醇（或DMSO）含量太低；
（3）染液太陈旧；
（4）温度太高。
2.染色浅（色调平衡）染料含量少
（1）染料不纯；
（2）称量或稀释错误；
（3）染料沉淀（见1）。
3.白细胞核呈蓝色或中性粒细胞无颗粒
（1）染料含量太少（见2）；
（2）甲醇（或DMSO）含量太高；
（3）pH太低；
（4）染色时间长。
4.中性粒细胞呈“中毒”
（1）pH太高；
（2）染色时间长；
（3）AzureB浓度太高。
5.红细胞及嗜酸性颗粒太蓝
（1）pH太高；
（2）缓冲液不合适；
（3）染色时间太长。
（六）Diff‐Quik染色法
Diff‐Quik实际是Romanowsky‐Giemsa染色的改良法（具体参见R‐G染色章节）。
Diff‐Quik溶液Ⅰ包含伊红。Diff‐Quik溶液Ⅱ包含天青A和亚甲蓝（美蓝）。亚甲蓝是一种不纯的染料，容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。因此，用本染料液染色后，在同一涂片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合呈粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合呈蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合而呈淡紫色，称为中性物质。Diff‐Quik是商品化的试剂，最早用于鉴别寄生虫，近年来发现此类染色对FNAC检查实用价值巨大，由于其快速、简单且可永久保存，可作为FNAC样初查，是鉴定细胞数量多少、穿刺质量好坏的快速手段。
1.试剂配制
（1）Diff‐Quik染液。Diff‐Quik是商品化的试剂，可订购而无需自己配制。Diff‐Quik溶液Ⅰ包含伊红、缓冲液和0.001%叠氮化钠；Diff‐Quik溶液Ⅱ包含天青A和亚甲蓝及缓冲液。
（2）醋酸乙醇液。
85%乙醇368.0ml
蒸馏水132.0ml
醋酸1.25ml
先将乙醇和水混合，然后慢慢滴加醋酸。该液可置于室温下保存数月。
2.染色步骤。可严格按商品化的试剂说明进行，主要步骤如下：
（1）甲醇固定（空气干燥后）或直接入Diff‐Quik固定液1min。
（2）入伊红缓冲液即Diff‐Quik溶液Ⅰ2min。
（3）入亚甲蓝缓冲液即Diff‐Quik溶液Ⅱ4min。
（4）蒸馏水快速浸洗2～3次，每次1～2s。
（5）用醋酸乙醇液漂洗1～2s。
（6）蒸馏水浸洗2～4次，每次5s。
（7）水洗后即刻湿片镜检。
（8）晾干，有价值的片可二甲苯透明，封片后永久保存。
3.染色结果。细胞核呈蓝色，胞浆、胶原、肌纤维呈多色调的蓝色和粉红色，细菌包括幽门螺杆菌呈深蓝色，真菌（包括霉菌、酵母菌和伞菌等）呈深蓝色。
4.注意事项
（1）Diff‐Quik染色的注意事项类似于前述Giemsa染色和R‐G染色。
（2）相比而言Diff‐Quik染色在染色时间上具有明显的优势，且Diff‐Quik染色后的涂片不需脱色即可进行巴氏染色。
（3）在同一张染色片中偶见染色程度的差别，尤其对于未经处理的黏稠度较高、碎屑较多的标本，Diff‐Quik染色后的背景差，可能严重影响正常的形态学评估。
（4）由于细胞染色对氢离子浓度十分敏感，冲洗用水应近中性，冲洗应快速，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难。
（5）建议使用Diff‐Quik染液一周后废弃，平均每日可染片20～30张。
（6）Diff‐Quik染色可应用于组织切片，幽门螺杆菌感染的胃组织或任何感染革兰氏阴性菌属（如大肠杆菌）的组织片可染色阳性对照。
（七）PAS染色法
PAS（Periodic Acid Schiff）染色是一项极其有用而应用广泛的技术，其原理是含有乙二醇基或氨基烷基氨衍生物的物质（绝大多数为多糖分子）被过碘酸氧化为双醛，双醛与Schiff试剂（无色品红液）结合，形成不溶解的洋红色复合物。对这种染色呈阳性反应者包括糖原及含有多糖分子的一大类物质（详见《病理规范》），为了进一步鉴定和区分这些物质，可通过一系列酶消化对照、阻断反应和其他染色技术作为补充手段。
1.试剂配制
（1）0.5%过碘酸水溶液。
过碘酸0.5g、蒸馏水100ml，溶解后用小口磨砂瓶盛装，4℃冰箱保存，使用前恢复至室温。
（2）无色品红试剂（Schiff试剂）。
碱性品红1g、蒸馏水100ml、偏重亚硫酸钠（或钾）2g、IN盐酸20ml、活性炭0.3g，水加热至沸腾，离开热源，冷却至60℃，加入碱性品红。过滤后加入偏重亚硫酸钠（或钾）和盐酸，将该溶液倒入有盖的黑瓶中，室温下放置18～24h。加入活性炭，剧烈摇动1min。过滤溶液，0～5℃储存，试剂变粉红色时应丢弃。
（3）偏重亚硫酸钠溶液。
原液：10%偏重亚硫酸钠水溶液
工作液：5ml原液与100ml蒸馏水混合
（4）Pal摧s漂白粉。
草酸0.5g、亚硫酸钾0.5g、蒸馏水100ml。
（5）1.0%固绿FCF醋酸溶液。
固绿FCF1g、醋酸100ml。
（6）Weigert摧s铁苏木精。
溶液A：
苏木精1g85%乙醇100ml
溶液B：
28%水合三氯化铁4ml
蒸馏水85ml、浓盐酸1ml。
工作液：等量的A与B混合。
2.染色步骤
（1）经85%乙醇固定的涂片蒸馏水浸洗15次。
（2）过碘酸10min。
（3）自来水冲洗10min后，蒸馏水15min。
（4）品红试剂15min。
（5）偏重亚硫酸钠Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2min。
（6）自来水冲洗10min。
（7）Weigert摧s苏木素4min后，自来水冲洗5～10min。
（8）Pal摧s漂白粉浸洗1次后，自来水冲洗5min后，蒸馏水浸洗15次。
