牛顿最初成名主要是靠光学上的伟大成就。他在自然科学上的发明与发现，最早成熟的是关于光学的思想和研究，当他成为卢卡斯讲座教授时，第一次授课的题目并不是《论无穷级数分析》，而是光学。
牛顿在上大学期间，已经开始了对光的研究。1672年，牛顿把自己的研究成果发表在《皇家学会哲学杂志》上，这是他第一次公开发表的论文。
牛顿在发表论文前，曾为此准备了光学讲课，曾仔细地作了关于两个平面玻璃之间和曲面玻璃与平面玻璃之间充以空气或水的折射实验。他把曲率半径很大的凸透镜放在平板玻璃上，当用白光照射它时，见到透镜与玻璃板接触处出现一组彩色同心环，当用单色光照射时，则在接触点处出现一组明暗相间的同心环，均匀照射却得到了不均匀的光强分布。这便是光的干涉中的有名的牛顿环实验。他在《光学讲义》中写道：
“当凸透镜与平面玻璃之间的空气或水受到压力时，不仅在尖部屈服于压力，而且也相继地在尖部周围产生几个轻微的同心圆圈，这种同心圆圈也可能由玻璃状液体的缺陷产生，因此薄膜变得松弛，或许由其他的原因也可产生，然而会小些。”
“它们仍能将光线折射到视网膜上，于是显示出不同的色环。色环的周期是随着薄膜厚度产生质的变化，而同一周期内的色环序列因薄膜厚度的增加而由紫向红依次量变。对于同一周期的同一种彩色光环来说，空气的最宽，水的次之，玻璃的最窄。”
牛顿认为并不是“玻璃的表面或任何平滑透明的物体在反射光，光反射的原因是‘以太’在玻璃和空气或任何相容物体中的差异”。
牛顿随后又谈到了“以太”的脉冲。脉冲包含着他对周期色圈的力学解释。脉冲并不是光，而是“以太”中的振动，是光粒子打在薄膜的第一层表面上而引起的，它决定该粒子能否穿透第二层表面。若可以，则为透射；若不能，则为发射。
牛顿成功地确定了光谱一端紫色与另一端红色的脉冲比率，这一比率一直是牛顿对固体的颜色进行定量处理的实验基础。
牛顿对光的干涉现象又做了另外一个实验。牛顿左手拿一根细管子，右手端一个肥皂水盒，当用管子对着肥皂水吹气时，盆里就会出现很多泡泡。把肥皂水的泡泡放在阳光下，就会产生美丽的环纹，于是他决定要研究其中的原理。
实验后，他发现光透过透明的薄膜时，会产生一圈圈往外扩展的五彩环纹，环纹与环纹间是以黑色隔开的。这些环纹还会依光谱的顺序排列，至于环纹的大小则因颜色不同而有差异。
经过无数次艰难的实验，牛顿终于成功地用数学公式表明环色与薄膜厚度的关系，也得到了光的干涉图样。
牛顿在皇家学会宣读的论文中心论点认为，白色的光是通常的颜色，这是由折射率不同的光线按照一定比例组合而成。根据这一论点，牛顿揭示出颜色的起源，从而得出一些非常重要的结论：
“颜色并非以往所认为的那样，是从自然物体的折射或反射中所导出的光的性能，而是一种原始的、天生的，并在不同光线中有不同的性质。”
“有些光线倾向于显示红色而不显示其他的颜色，有些倾向于显示黄色，有些则显示绿色等。那些显著的颜色有它们固有的特殊光线，它们中间的各种色调也都有它们固有的特殊光线。”
自1666～1670年，他才完全研究出固体颜色的详细情况。到1670年，牛顿在光学方面的创造性工作几乎接近尾声。
1675年12月，牛顿的另一篇关于光和颜色理论的新论文在皇家学会的会议上宣读了。
牛顿的这篇新的关于光和颜色的论文探讨了光的本性，提出了微粒说，无疑这是光学研究中的重要贡献。
光的微粒说作为近代的一种科学上的光组成理论，与光的波动说并立，对后来光学和辐射的研究产生了重要影响。牛顿是近代学的微粒说的提出者，并在著名的波粒说争论史上一度居于统治地位。
微粒说是牛顿在17世纪时发表的，他对光的本性是这样认为的：光是由一颗颗像小弹丸一样的机械微粒所组成的粒子流，发光物体接连不断地向周围空间发射高速直线飞行的光粒子流，一旦这些光粒子进入人的眼睛，冲击视网膜，就引起了视觉，这就是光的微粒说。
牛顿对光微粒说的进一步研究发生在光学讲课过程中。在1670年4月的光学讲义中，他第一次提出不同颜色粉末的混合实验，不但用这种实验证明他的颜色理论，而且清楚地印证了他的微粒说。他说：
“最后，通常观察到不同颜色的粉末混在一起时，一种新的颜色就出现了。而且，如果用显微镜考察这些粉末，可看到全都是具有它们自己的颜色。因此，它们自己的颜色并未因这些粉末的混合而破坏，而却是因为混合才有一种新的颜色产生出来。很清楚，同一种颜色是从几个三棱镜引起的颜色及几种粉末的颜色的混合所产生的。”
牛顿将光通过三棱镜折射后的混合色和粉末混合产生的颜色对比，说明光的组成和复合色由基色的混合所形成的道理。
他在向皇家学会报告的第一篇光学论文中，批驳了笛卡儿的光理论。他说如果光是由小球体组成并穿过以太，必然受到阻力，使其径迹弯曲，但实验中未发现其径迹有曲度，因此，他逐渐排除这些猜测，着手做窗上开小孔的光学实验。这篇论文没有明确谈他的微粒说，但包含着这样的思想，以致引起胡克的批评。
但是，牛顿在1672年6月11日给奥尔登伯格的信中，谈到胡克说他认为光是一个物体并将它说成是他的假设时，表示“我曾经宁愿把它们看作光粒子的各种运动形式中大小在大脑中激发的感觉模式，它是光粒子对感觉器官造成的各种机械的影像，像我在说光的形体的地方所表示的”，“但是，假定我提出了这个假设，我不了解胡克先生为什么竟这样竭力反对它”。
牛顿这段话是针对胡克指责他发表的第一篇光学论文中的命题所说的，牛顿认为光是实体的思想与他的光粒子说是符合的。但是，在他的光和颜色理论受到胡克和惠更斯等人的批评后，他开始向以太说妥协，并一度由粒子和以太波的变化相结合的方法说明光和颜色。
牛顿在1665～1666年间发现颜色与光线折射的关系，他根据折射定律认识到光经过透镜分成多种折射的不同颜色光线，则透镜成像必然产生色散像差，使折射式望远镜的清晰度减弱。
牛顿用微粒说轻而易举地解释了光的直进、反射和折射现象。由于微粒说通俗易懂，又能解释常见的一些光学现象，所以很快获得了人们的承认和支持。
牛顿由于了解了白光的组成，因而于1668年设计制成了第一架反射式望远镜。这种望远镜能反射较广光谱范围的光而无色差，容易获得较大的口径，同时对球差也有校正。这样牛顿为现代大型天文望远镜的制造奠定了基础。此外，牛顿还考察了光线通过冰洲石的双折射现象。
牛顿把对光学的研究理论整理成《光学》一书。《光学》的出版，使牛顿成为科学界的头等人物。
