武汉三镇光复的消息传到北京，清政府惊恐不已，慌忙谕令湖广总督瑞澄和新军第八镇统制张彪革职留任，戴罪立功，并派陆军大臣荫昌亲临武汉前线督剿起义军，同时令萨镇冰率兵舰，程允和率水师进抵武汉配合作战。但北洋六镇（师）原是袁世凯一手训练出来的军阀武装。慈禧和光绪死后，摄政王载沣为削去袁世凯的军权减少威胁，1909年将袁世凯罢黜放归河南老家。但北洋六镇的实权在其爪牙冯国璋、段祺瑞控制之下，所以荫昌指挥不灵。这时载沣不得不重新起用袁世凯，授袁世凯为湖广总督，前往湖北督办剿杀起义军事宜，段祺瑞和冯国璋也亲临前线。
当时敌我双方的兵力对比是，敌方共三个军：陆军第四镇和混成第三协、混成第十一协编为第一军，陆军第五镇和混成第五协、混成第三十九协编为第二军，禁卫军、陆军第一镇编为第三军。共约3万多人。除第三军留守京畿外，其他两军都调往武汉前线，并有海军巡洋舰、炮舰、鱼雷艇等15艘靠近武汉江面。我方：原武汉新军大部分已归属革命政府，只有辎重第八营等少数营队被瑞澄、张彪带走。但武汉新军在起义中死伤甚多，已不过几千人。为加强革命武装，湖北革命军政府一方面继续改编归顺的新军，另一方面在武汉附近招募新兵，不到一星期就征兵达3万多人，其中大多数是工人、农民和青年学生，编成步兵4协，担任武汉各区防卫任务。第一区由统领吴兆麟率步兵第一协防守汉阳，第二区由统领何锡蕃率步兵第二协防守汉口，第三区由统领成炳荣率第三协防守武胜门外两望山至青山一带，第四区由统领张廷辅率第四协防守武昌。不久，根据战事需要又扩建了步兵4协，这样湖北革命军共有8协，具有一定的战站斗力。
清政府认为，武汉三镇是首先在全国燃起战火的地方，剿杀革命军应集中全力于武汉三镇，根据地义旗一举，烈火燃遍全国，城池一拔，则革命烟消云散，所以要拼出老本拿下武汉三镇。革命军政府则认为，武汉三镇是全国革命首先取得成功的地方，是革命的中心和旗帜，自然要全力以赴，浴血奋战保卫胜利果实。当时响应起义的各省也派兵前往支援，还有不少工人和学生自发前往参军参战，革命气氛昂扬空前，一场革命与反革命的激战在即。清军首攻汉口，武汉三镇保卫战也就从这里开始。10月15日清军先头部队开赴武胜关一带，向离汉口二十里的前沿刘家庙逼近。当时清军第八镇统制张彪只带辎重第八营残部逃至刘家庙固守，汉口革命军为扼制清军南下，准备先行打下刘家庙。于是10月18日革命军在第二协协统何锡蕃的指挥下向刘家庙发起进攻，张彪所率清军利用堑壕负隅顽抗。在激战中，南下清军用火车载来步兵一标、炮兵一队增援，这时埋伏在铁路两旁的革命军见敌人火车进入埋伏圈，突然开火，冲杀过去，并将一段铁路炸毁，使清军列车车头脱轨，车厢倾倒于路外，清军纷纷从车厢里钻出抱头鼠窜，革命军枪炮声、喊杀声震耳欲聋，清军死伤惨重，被消灭400多人，杀伤无数，尸体枪械，一片狼藉。堑壕中的清军见援军惨败，便逃至刘家庙以北滠口一带。列车中的枪械、粮食等军需品尽被革命军截获，革命军在欢呼声中占领刘家庙。
在清军溃败之际，如革命军乘胜追击，必定会势如破竹扩大战果，但革命军汉口前线总指挥何锡蕃缺乏战略眼光，对形势估计不足，在迟疑不决之中敌人喘息已定，占据有利地形，在要隘之处架起机枪死守。这时革命军战士一再请求，组成了敢死队发起冲锋，但屡攻不克，损失惨重。在奋力指挥中何锡蕃手臂受伤，10月19日革命军政府任命张景良为汉口前线总指挥。
清军固守于三道桥北端，并陆续向祁家湾、滠口等地派出增援部队，企图反扑。这时革命军政府曾令张景良率军进攻滠口，但张景良按兵不动，故意拖延，致使贻误战机。10月22日革命军进攻三道桥北失利，退驻三道桥南。清军则分兵三路反攻，一路沿铁路主攻刘家庙，一路由府河、新沟出蔡甸攻汉阳，一路由阳逻渡青山下游，逼武昌。10月26日在阳逻江面的清海军偷渡谌家矶，向革命军阵地发起猛攻。因革命军对清军偷渡袭击缺乏准备，致使伤亡巨大，阵亡500多人。与此同时，滠口也与之呼应，趁势攻过三道桥，水陆夹攻刘家庙，经过反复拉锯战，最后刘家庙失守，革命军退至汉口市区。
这时同盟会领导人黄兴自香港绕道上海，10月28日化装来到武汉，在汉口满春荣园设立了总司令部，亲临前线指挥作战。黄兴的到来使在鏖战中的武汉军民受到很大鼓舞，革命军骑马高擎“黄兴到”的大旗，遍游武汉三镇，稳定了军心，震慑了敌人。但此时汉口革命军仅有5000人左右，在清军的猛烈攻击下局势危急。这时黎元洪在汉阳请黄兴从速渡江商议防务，实际上是意欲放弃汉口。11月1日革命军奉命放弃汉口，退守汉阳。在汉口保卫战中张景良贻误战机是导致失败的重要原因，原来张景良本是混入革命军的黎元洪的嫡系，清军大举南下时，他便意欲叛变革命，在刘家庙一战中他不仅贻误战机，而且充当敌人内奸，后来革命军发现了他通敌的破绽，终于将他枪毙正法。
清军攻占汉口后，随即全力进攻汉阳。当时清军总兵力为3万人，70门炮，40挺机枪。革命军退守汉阳后仍有1万多人。加上湖南来援的革命军，共2万多人，而且江面舰只也掌握在革命军手中，形成对峙局面。黄兴由汉口到武昌，当时革命党人酝酿推举黄兴为湖北湖南大都督领导革命军，而新军中靠近黎元洪的人则主张仍由黎元洪任都督，由黎任命黄兴为战时总司令。后一种意见占了上风，11月4日黄兴被任命为战时总司令，李书诚任参谋长。
黄兴任战时总司令后曾于11月16日组织一次偷袭汉口的战斗，但由于组织不够严密，被清军侦察到行动路线而有所准备，致使偷袭失败。10月21日清军分兵两路向汉阳发起攻击，一路从孝感绕道蔡甸渡汉水逼近汉阳，一路从舵落、琴断口架设浮桥渡汉水逼近美娘山、仙女山，形成两翼包围态势。革命军则在汉阳周围的美娘山、扁担山、磨盘山等重要据点坚守，多次打退清军进攻，清军则反复冲击，重要据点几经易手，11月27日汉阳终于失守。黄兴在汉阳失守后回到上海，黎元洪本想放弃武昌投降清军，但遭到革命党人的坚决反对，于是任蒋翊武为战时总司令，据长江之险以御敌。
武汉三镇保卫战自10月中旬到11月下旬，坚持40余日，从革命全局来看，吸引了清军的主力部队，为全国革命形势的发展创造了条件，大大鼓舞了全国人民；但从武汉局部来看，它失败了，全国首义的根据地被敌人所攻占。推究失败的原因，一是缺乏掌握革命政权的根本观念，一开始就被妥协派窃取了军政大权，黎元洪被推上政治舞台显然是革命军的重大失误。二是在战略战术上缺乏经验，尤其是没有发动群众机动灵活地打击敌人，一味据守，结果使清军得以发挥军事上的优势。三是袁世凯投靠帝国主义，使清军得到一定军事物资的支持而革命军武器装备则远不如清军。
